09月30 【成功案例】生物化學和比較轉(zhuǎn)錄組學分析鑒定紫斑牡丹中與色素形成相關的候選基因
Biochemical and Comparative Transcriptomic?Analyses Identify Candidate Genes Related to?Variegation Formation in Paeonia rockii
PMID:?28817092
雜志：Molecules
影響因子：2.861
研究背景：牡丹是木本灌木，芍藥屬牡丹組，是一種重要的傳統(tǒng)觀賞植物，花瓣大而有吸引力。在十個牡丹野生種中P. rockii（紫斑牡丹）白色花瓣的基部有明顯的黑色彩斑，而P. ostii（鳳丹）沒有花瓣雜色?；ǖ念伾悄档さ囊粋€重要的商業(yè)特性，花瓣顏色的多樣性可提高牡丹的觀賞價值，因此闡明P. rockii中紫斑的形成機制具有重要意義。眾所周知，牡丹的基因很大組（13–16 GB），往往具有較高的雜合度和配子體自交不親和性，在缺少完整的基因組序列的情況下，RNA測序技術是獲得基因組表達信息最有效的工具。到目前為止，幾個花青素生物合成相關基因在牡丹中已確定，但是色斑形成的分子機制還不清楚。
材料方法：
取P. rockii (PR)，P. ostii?(PO)和PR與PO的雜交F1代（RO），分別收集4月底到五月初5個不同開放階段的三種牡丹的花瓣進行轉(zhuǎn)錄組分析，三個生物學重復。取階段5（完全開放期）的花瓣進行形態(tài)解剖分析和色素含量分析。
技術路線：
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實驗結果：
- 花瓣顏色測量，形態(tài)解剖分析和色素含量分析
為了確定色斑性狀的遺傳背景，利用PO和PR雜交產(chǎn)生F1植株（RO），所有60株F1植株在花瓣的基部都有色斑存在（Figure 1），PR的彩斑呈顯性遺傳。根據(jù)英國皇家園藝學會比色卡（RHSCC），在階段5的PR和RO的背景與PO花瓣一樣為白色，而在第5階段的PR和RO的色斑顏色有差異。PR色斑為深紫色，而RO的為紫紅色。
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Figure 1.?Fully open flowers of individuals selected for sequencing.
為了闡明其色斑形成的機制，作者檢測了色素在PR, PO和RO花瓣中的空間位置。在非色斑花瓣中沒有色素細胞（Figure 2C，I，L）。相反，色素細胞主要位于色斑花瓣的上、下表皮和柵欄組織中（Figure 2F，O）。色素細胞在PR的雜色相應也位于表皮內(nèi)（正面），這可能有助于PR色斑更深的顏色（圖左）。在非雜色花瓣中，表皮細胞是無色的（圖2A，B，G – K）。
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Figure 2.?Cellular features of the flower materials.
HPLC分析表明，在P. rockii和F1代牡丹花瓣的色素中含有四種花青素（CY3G5G，CY3G，芍藥色素（Pn）3G5G和Pn3G）。PR的色斑顯示出“Cy > Pn”的表型，CY3G是含量最高的花青素(28.36 ± 0.063 mg/g)。RO顯示出“Pn > CY”的表型，有比較高的Pn3G5G（4.27±0.046毫克/克）和Cy3G5G（2.51±0.011毫克/克）含量。在PR和RO背景花瓣和全部的PO花瓣中沒有檢測到花青素的存在。對色斑中成分的進一步分析發(fā)現(xiàn)，花瓣顏色受色素種類和濃度的強烈影響，這促使作者進一步研究轉(zhuǎn)錄水平上的分子過程。
- 轉(zhuǎn)錄組測序和注釋
為了確定參與PR色斑形成的關鍵基因，作者利用Illumina HiseqTM?2500對PR、PO和RO進行了比較轉(zhuǎn)錄組學分析。九個文庫中總共產(chǎn)生了181866條unigenes，其中57913（31.84%），43307（23.81%），34125（18.76%），18986（10.44%），33409（18.37%），24154（13.28%），47410（26.07%）條unigenes分別被注釋到了NR、PFAM、SwissProt、KEGG、GO、COG和KOG數(shù)據(jù)庫中。
與KEGG數(shù)據(jù)庫比對發(fā)現(xiàn)這些unigenes與代謝、遺傳信息處理，生物系統(tǒng)和細胞過程中的130個信號通路有關。目前已知，四個次生代謝途徑與花青素相關：苯基丙酸類生物合成（250，1.04%），類黃酮合成（64，0.26%），花色素苷生物合成（4，0.02%）以及黃酮和黃酮醇的生物合成（6，0.02%）。
- P. rockii，P. ostii 和F1代轉(zhuǎn)錄組比較分析
根據(jù)三種樣品的特殊表達模式，將9個RNA-seq樣品中的基因表達變化分為三組（Figure 4A）。此外，RO的基因表達水平與PO更類似。為了鑒定P. rockii中彩斑形成的候選基因，進行了PR、PO和RO文庫的比較分析。PO花瓣與PR花瓣相比，基于閾值FDR＜0.001和| log2Ratio | > 1，7065條unigenes被確定為差異表達基因（DEGs），包含3174個上調(diào)和3918個下調(diào)基因（Figure 4B）。PR vs. RO中有4113個DEGs，2615個上調(diào)，2332個下調(diào)。而且，有691條unigenes在所有三個組中顯示出顯著的表達差異。
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Figure 4. Gene expression profiles in three differentially colored tree peonies.
三組DEGs的GO富集分析發(fā)現(xiàn)9191個DEGs被分類到50個功能組，包含生物學過程（20組）、細胞組分（14組）和分子功能分類（16組）。此外，還利用KEGG數(shù)據(jù)庫對DEGs進行了功能注釋分析，PO vs. PR中與色素沉著相關的四條信號通路被鑒定出來：苯基丙酸類生物合成（39DEGs，ko00940），類黃酮化合物的生物合成（DEGs，ko00941）、黃酮和黃酮醇的生物合成（DEGs，ko00944）以及花色素苷生物合成（DEGs，ko00942）。PR vs. RO中與色素沉著相關的三條信號通路被鑒定出來：苯基丙酸類生物合成（29 DEGs），類黃酮化合物的生物合成（4DEGs）和花色素苷生物合成（1DEGs）。相比之下，PO?vs.RO中鑒定了苯基丙酸類生物合成（25DEGs），類黃酮化合物的生物合成（6DEGs），黃酮和黃酮醇的生物合成（1DEGs）和花色素苷生物合成（1DEGs）四條通路。
作者對KEGG分析中鑒定的代謝通路表達譜進行了聚類（Figure 5）。參與色素沉著的四個途徑在PO中豐度較高，類黃酮生物合在PO和RO中有很高的豐度，PR中花色素苷生物合成通路有高豐度。
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Figure 5. Expression profiles of 130 KEGG pathways.
以往的研究已經(jīng)證明，牡丹彩斑的形成主要取決于花青素的空間生物合成（Cy和Pn）。因此，對花青素代謝途徑中核心基因的表達模式進行了詳細研究，許多基因表達水平有顯著差異（Figure 6）。
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Figure 6. A detailed schematic of anthocyanin metabolism related to?flower pigmentation in PO, PR and RO.
此外，對R2R3-MYB，bHLH和WD40的表達水平分析顯示在PR或RO中一些R2R3-MYB，bHLH和WD40基因顯著上調(diào)（Figure 7）。為了分析在PR中與色斑形成相關的苯基丙酸類生物合成，類黃酮化合物的生物合成，黃酮和黃酮醇的生物合成和花色素苷生物合成的相互作用，構建了一個共表達網(wǎng)絡（Figure 8）。
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Figure 7. All unigenes encoding the R2R3-MYB.
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Figure 8. A co-expression network of the DEGs involved in pigmentation.
- 差異表達基因在不同時期表達水平的驗證
為了驗證從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)獲得的表達譜，選取了12個色素沉著相關DEGs進行了qRT-PCR分析以評估它們在PO、PR和RO花瓣發(fā)育中的表達模式。結果表明，12個選取的DEGs的表達模式與Illumina測序獲得的表達模式相一致。
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結論：經(jīng)轉(zhuǎn)錄組測序產(chǎn)生了181866條unigenes，包括各種參與花青素生物合成和合成調(diào)控的相關基因。暗紫色和紫紅色色斑的形成主要與花青色素（Cy）和芍藥色素（Pn）為基礎的花青素的比例有關。本文結果表明各種色斑圖案是由花青素生物合成基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控產(chǎn)生的，R2R3-MYBs轉(zhuǎn)錄譜為闡明這個特征產(chǎn)生的機制提供了線索。